之前我们介绍过细胞图谱工作的全球三个主要联盟：人类生物分子图谱计划(HuBMAP)，人类肿瘤图谱网络(HTAN)和人类细胞图谱(HCA)。每个联盟都专注于与他们的图谱工作相关的具体目标。人类细胞图谱（Human Cell Atlas，HCA）计划的使命是创建所有人类细胞的综合参考图谱，在细胞水平上描述和定义健康与疾病的状态。

近日，HCA分支的人类乳腺细胞图谱（HBCA）项目的首席研究员Kai Kessenbrock博士携手MD安德森癌症中心和加州大学的研究团队，在《Nature》（IF=69.504)杂志上发表了题为“A spatially resolved single-cell genomic atlas of the adult human breast”的研究论文[1]。

该研究不仅从空间生物学角度阐明了乳腺组织中各种细胞亚群之间的关系，还描绘出迄今为止最为全面的人类乳腺细胞图谱，为研究乳房生理和疾病过程提供了详细的单细胞空间多组学信息。

图1 乳腺组织中细胞亚群分布示意图

|   研究背景

人类乳房属于顶端分泌器官（apocrine organ），其最主要的生理作用体现在产生乳汁以哺育新生的婴儿。这种乳汁分泌功能是由高度分支的小叶单位介导的，乳汁通过乳腺组织内的导管网络运输。乳腺上皮系统被密集的血管和淋巴管网包围，并嵌入富含脂肪的组织中。组织病理学研究结果表明，人类乳腺组织内主要有四种组织区域特征：末端导管小叶单位（terminal ductal lobular units，TDLU）和密集的分支上皮小叶结构区；由双层上皮组成的管状导管区；富含细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的结缔组织区；和脂肪富集区。每个区域内不仅有大量的乳腺上皮细胞，还有成纤维细胞、脂肪细胞和多种免疫细胞。要刻画出乳腺组织的细胞图谱，就需要明确组织内各种细胞亚群之间的相关性及其在生理和病理状态下的变化。

在早期研究中常用的全样本分析工具（如蛋白质印迹、定量PCR和bulk-RNA测序等）虽然能够实现单次分析由数万到数百万个细胞组成的样本，但单个细胞亚群中的关键性差异会被样本中其他细胞亚群平均化，容易错过样本中一些细胞亚群的细节信息。近年来，单细胞技术和空间组学技术在组织样本解析过程中的联合使用，不仅可以帮助我们在单细胞水平检测每一个细胞中分子表达情况，还能展示出各个细胞亚群在组织中所处的位置及细胞之间的空间相关性。

2016年HCA计划启动至今，空间多组学联用被更广泛地应用在组织图谱解析过程中，通过研究发育和生理/病理活动中的分子机制去探索不同类型的细胞聚集并形成组织的原因。本研究的目的是以单细胞分辨率绘制人类乳腺组织中存在的所有细胞类型、状态及其空间分布多组学图谱。

|   研究思路

该HBCA项目共收集了来自132例女性手术患者的220个乳腺组织样本。所采集到的样本一部分用于单细胞转录组测序（scRNA-seq）和单核转录组测序（snRNA-seq），另一部分用于Akoya空间单细胞蛋白组（PhenoCycler）和空间转录组检测。考虑到个体在经历青春期、怀孕、哺乳和更年期等过程中会伴随乳腺组织重建，作者在数据分析时还考虑到种族、年龄和生育情况等因素。在先后解析了乳腺组织中细胞亚群、细胞邻域（Cellular neighborhood）、上皮细胞分布、免疫细胞分布、成纤维细胞异质性、脂肪细胞分布、血管和周细胞分布后，研究团队绘制出了迄今为止样本量最大、分析最为全面的人类乳腺细胞图谱。

图2 乳腺组织示意图和HBCA研究工作流程

| 研究过程

1. 确定乳腺组织中的主要细胞类型

首先，作者通过scRNA-seq技术检测了167个乳腺组织样本中收集到的714331个细胞，并通过聚类分析确定这些细胞由10种不同类型的细胞组成（图3c和3d，包括：基细胞（Basal）、激素反应型腔细胞（LumHR）、分泌型腔细胞（LumSec）、成纤维细胞、淋巴样细胞、血管细胞、周细胞、髓系细胞、T细胞和B细胞）。由于技术限制，scRNA-seq结果中缺少了一些组织中常见细胞类型的数据（如脂肪细胞）。所以，作者进一步通过snRNA-seq技术得到了117346个细胞核的数据。分析结果表明，乳腺组织中主要有11种细胞类型（图3e和3f）：基底细胞、LumHR细胞、LumSec细胞、成纤维细胞、淋巴样细胞、血管细胞、周细胞、髓系细胞、T细胞、肥大细胞和脂肪细胞。细胞间作用分析结果进一步验证了作者通过测序技术在乳腺组织中找到的12个细胞类型。（详见原文补充材料）

图3 乳腺组织scRNA-seq和snRNA-seq检测

2.乳腺组织中细胞空间分布检测和细胞邻域分析

接下来，作者利用主流空间组学技术（两种空间转录组技术和Akoya空间单细胞蛋白组技术）检测乳腺组织中各种细胞亚群的空间分布情况。结果表明，乳腺组织中有9个特征性邻域（图4b和4c），且乳腺上皮细胞和非上皮细胞之间存在紧密的空间相关性（图4e和4h）。随后，作者分别研究上皮细胞和非上皮细胞的分布特征。

图4 乳腺组织中主要细胞类型的空间组学分析

3. 乳腺上皮细胞分析

作者在前期研究中通过单细胞技术鉴定了乳腺上皮细胞分为基细胞（Basal）、激素反应型腔细胞（LumHR）和分泌型腔细胞（LumSec）[2]。在本研究中作者详细地分析了这几种乳腺上皮细胞的功能异质性，定义了LumHR细胞的3种不同活化形式的亚群和LumSec细胞的7种不同活化形式的亚群（图5f，5g和5j）。另外，作者还在导管区域和小叶区域通过空间多组学检测确定了几种乳腺上皮细胞的空间分布规律（图5n和5p），完成了乳腺上皮细胞的空间图谱。

图5 乳腺上皮细胞分析

4. 乳腺组织中非上皮细胞分析

以往的乳腺相关研究中常常忽略非上皮细胞（如免疫细胞）在乳腺组织中的“地位”，但本研究发现这些细胞不仅在乳腺组织中占有较高比例，且与乳腺上皮细胞存在显著的空间相关性。在对乳腺组织中的免疫细胞解析过程中，作者发现免疫细胞不仅在生理状态下占比高达16.7%，并且呈现出非常丰富的异质性。分析结果表明，在乳腺组织中：T细胞和NK细胞有14种不同活化形式的亚群（图6f和6g）；B细胞有5种不同活化形式的亚群（图6h和6i）；髓系细胞有15种不同活化形式的亚群（图6j和6k）。随后，作者用空间分布检测在乳腺组织的不同分区（小叶区、导管区、结缔组织和脂肪区）中验证了免疫细胞的空间分布。（详见原文补充材料）

图6 乳腺组织免疫微环境分析

最后，作者对乳腺组织中常见的成纤维细胞、脂肪细胞、血管细胞、淋巴样细胞和周细胞进行了异质性和空间分布分析（详见原文），详细地描绘出乳腺组织中各种细胞的活化形式与空间分布关系的图谱（图1）。不仅如此，作者还对比了不同患者种族、年龄和生理状态来源的样本之间的细胞异质性差异，丰富了人类乳腺细胞图谱中的异质性参数。

|   总结

本研究实现了4种前沿技术的空间多组学联用，结合各种技术的优势实现了人类乳腺组织微环境的空间单细胞解析，为未来的乳腺相关疾病研究提供了组织细胞学依据。正如Kessenbrock博士所说：“将空间分析与单细胞RNA测序的力量相结合，能帮助我们获得更多细胞与细胞、受体与配体之间的空间分布信息，从多个维度解读组织微环境。”空间多组学联用已然成为当今组织样本解析的不二选择。

可通过https://www.akoyabio.com/blog/webinar-rewind-the-human-cell-atlas/   回顾Kessenbrock博士参加Akoya Biosciences网络研讨会对该项工作的介绍。

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|   参考文献

1. Kumar T, Nee K, Wei R, et al. A spatially resolved single-cell genomic atlas of the adult human breast. Nature. 2023 Jun 28.

2. Nguyen QH, Pervolarakis N, Blake K, et al. Profiling human breast epithelial cells using single cell RNA sequencing identifies cell diversity. Nat Commun. 2018 May 23;9(1):2028.

该文章转自：AkoyaBio微信公众号