该研究通过检测18个蛋白marker，诠释了10多种不同的细胞类型。然后通过神经网络模型构建了12个空间区域（districts，d）。

d0、d1、d5 和 d11区包含89%的上皮细胞。d2 和 d10主要包含基质细胞，d7是内皮细胞区。d9区主要是髓细胞 (78%) 和一些 CD4+ T细胞 (11%)。d6主要包含了CD20+ B细胞 (10%)、CD4+ T细胞(13%)、CD8+ T 细胞 (18%)、髓细胞 (19%) 和基质细胞 (37%)。大多数CD138+ 浆细胞 (95%) 位于 d8 区，与上皮细胞、髓细胞和基质细胞 (>10%) 共定位。d3和d4 区以淋巴细胞为主，其中d3含有最多的 CD4+ T 细胞(39%) 和 CD8+T 细胞(41%)，而d4 含有最多的B细胞 (54%)。

B细胞优势区d4是基线时响应者中唯一比例和密度较高的区域，同时时富含T细胞的d6 密度也更高。免疫区d3、d6、d8 和 d9仅在应答者联合治疗（RTPD1）后的样本中比例增加，其中d3和d6 的比例和密度都高于无应答者。相反，RTPD1 后响应者中的上皮区 d0、d1 和 d11消失，而无应答者中没有变化。AUROC分析发现了类似的趋势，治疗前，d4 是唯一与应答相关的区域 (AUROC > 0.75)，但在 RTPD1 后，所有免疫丰富区域（d3、d4、d6、d8 和 d9）在应答者中的比例和密度均较高。这些结果说明了治疗重塑了TNBC的免疫微环境。

无监督聚类分析活检的空间区域可以将肿瘤组织分为3 组，其中大多数无应答者形成一个亚组NR，而响应患者形成两个亚组: R1和 R2。应答组表现出不同的免疫轨迹，其中 R1 开始时免疫细胞密度较高，但每次治疗后免疫细胞密度有所下降，而 R2 仅在 RTPD1 后看到免疫细胞密度增加。空间关系上，在基线期和单独免疫治疗后，R1中T 细胞区域d3/d6附近具有更多的B细胞区域d4，但这种差异在 RTPD1 后消失。同样的，在基线期， R1 中T细胞邻近 d9 髓细胞区域，但这种差异也在 RTPD1 后也消失。

研究者分析了配对的CD45+ 细胞scRNA-seq 数据。scRNA-seq鉴定了B细胞/浆细胞、T 细胞、髓细胞和肥大细胞。并且通过差异基因表达分析 (DGEA) 和 CellTypist对 B细胞/浆细胞、T 细胞和髓细胞进行了亚群分析。相关性分析发现了PCF空间区域和 scRNA-seq 细胞亚群之间存在一致性。d4主要由 B 细胞组成，其丰度与 scRNA-seq 数据集中 B细胞的丰度相关性最强。同样，scRNA-seq 中T细胞丰度与 T 细胞富集区 d3、d6 和 d9 相关。在细胞亚群水平上，CD20+ sc-b0、sc-b2 亚群与 d4 的关联性最高。效应 T 细胞亚群 sc-t4 和 sc-t6 与 T 细胞区 d3、d6、d8 和 d9 表现出更强的相关性。值得注意的是， d8和 d9 与效应T细胞相关，也与抗原呈递巨噬细胞亚群 (sc-m11) 相关。研究者后续着重分析了效应T细胞扩增在空间上与抗原呈递巨噬细胞的富集具有显著相关性。对比分析发现了只有在R2响应组中，空间上d6/d9 共密度和 sc-t6 效应T细胞扩增具有显著相关性。

最终这项研究联合空间原位分析和单细胞测序，将TNBC患者对免疫治疗/放射治疗反应进行了分类。无应答者在治疗前后缺乏免疫浸润，并且表现出最小的治疗诱导的免疫变化。响应患者分为两组，在治疗前可通过分类器进行区分，其中一组在治疗前表现出高的MHC表达、存在三级淋巴结构，并表现出抗肿瘤免疫效能。另一组应答者在基线时与无应答者相似，只有在联合治疗后才会产生最大的免疫应答，其特征是细胞毒性 T 细胞和抗原呈递髓细胞相互作用。并且这些空间互作关系也在小鼠模型上得到了验证。

| PCF空间单细胞蛋白组学介绍

| PCF单细胞原位空间蛋白组学优势

Shiao SL, Gouin KH 3rd, Ing N, Ho A, Basho R et al. Single-cell and spatial profiling identify three response trajectories to pembrolizumab and radiation therapy in triple negative breast cancer. Cancer Cell. 2024;42(1):70-84.e8.